Puesta a punto de herramientas moleculares necesarias para la implementación del programa de selección genética ECUANARIA en langostino blanco (Litopennameus Vannamei), bajo condiciones industriales de cultivo

Abstract

El desarrollo de este estudio se realiza dentro del marco del proyecto ECUANARIA. Dicho proyecto consiste en desarrollar un programa de selección genética en camarón o langostino blanco (Litopenaeus vannamei) para caracteres de crecimiento y robustez en piscina o estero. El objeto de mi tesis es sólo parte del proyecto ECUANARIA, y consiste en optimizar y desarrollar una herramienta de diagnóstico de paternidad mediante múltiplex de PCR de marcadores microsatélites específicos de camarón, así como optimizar una herramienta de diagnóstico de los agentes infecciosos WSSV, IHHNV y NHP. Para verificar la utilidad de las herramientas, se realizan pruebas con muestras provenientes de la industria y salvajes (poblaciones). Se entrenó al personal de BIOGEMAR, S.A en las técnicas de diagnóstico y se han desarrollado unos protocolos de uso (Anexo I y Anexo II). Se han diseñado dos múltiplex de PCR de marcadores microsatélites para el diagnóstico de paternidad, denominadas LVANN1 y LVANN2. La primera con 7 marcadores, heterocigosidades observadas de entre 0,20 y 0,92, un PIC de entre 0,42 y 0,92 y un rango alélico de entre 4 y 18. La segunda con 6 marcadores microsatélites, heterocigosidades observadas de entre 0,25 y 0,87, un PIC de entre 0,35 y 0,86 y un rango alélico de entre 3 y 11. Los análisis de AMOVA con dichas mútlplex pusieron de manifiesto que la mayor parte de la variación está dentro de las poblaciones analizadas. Se ha desarrollado una reacción múltiplex de PCR para el diagnóstico simultáneo de las tres enfermedades más relevantes en el sector industrial de camarón en Ecuador (WSSV, IHHNV y NHP), mediante el uso de sondas TaqMan específicas para cada uno de los agentes infecciosos, haciendo factible la compatibilidad de todos los juegos de cebadores y sondas de los tres agentes patógenos y el diagnóstico simultáneo a bajo coste y alta especificidad en condiciones industriales.

The development of this study is carried out within the ECUANARIA project. The objective of ECUANARIA is to develop a genetic selection program in white prawn (Litopenaeus vannamei). The object of my thesis is only part of the ECUANARIA project and consists in optimizing and developing of a paternity diagnosis tool using PCR multiplex of shrimp specific microsatellite markers, as well as optimizing a tool of diagnosis of WSSV, IHHNV and EMS diseases. To verify the usefulness of the tools, tests were carried out with samples from the industry and wild (populations) The BIOGEMAR, S.A staff was trained in technologies of diagnosis, and two protocols were developed (Annex I and Annex II). Two PCR multiplex of microsatellite markers for paternity tests, named LVANN1 and LVANN2, have been designed. The first one with 7 markers, observed heterozygosities between 0.20 and 0.92, a PIC between 0.42 and 0.92 and an allelic range between 4 and 18. The second one with 6 microsatellite markers, observed heterozygosities between 0.25 and 0.87, a PIC of between 0.35 and 0.86 and an allelic range of between 3 and 11. The AMOVA analyzes by these multiplexes showed that most of the variation is within the analyzed populations. A PCR multiplex reaction has been developed for the simultaneous diagnosis of the three most relevant virus and bacteria in the shrimp industrial sector in Ecuador (WSSV, IHHNV and EMS), by using specific TaqMan probes for each of the infectious agents. Making feasible the compatibility of all sets of primers and probes of the three pathogens and the simultaneous diagnosis at low cost and high specificity in industrial conditions.