Monitorización de la calidad de playas mediante métodos moleculares

Abstract

El presente trabajo propone el establecimiento de nuevas metodologías, basadas en el genoma de los microorganismos, para el control de la calidad de las aguas, un aspecto que aunará el conocimiento científico y el de gestión según se aborda en la Directiva 2006/7/CE relativa a la gestión de la calidad de las aguas de baño. La monitorización de la calidad de las aguas marinas de uso recreacional, principalmente es llevada a cabo mediante técnicas bioquímicas que conllevan un alto coste de tiempo. El desarrollo de las técnicas moleculares y concretamente el diseño de sondas específicas para determinar microorganismos, ha permitido la optimización de los procesos de validación de calidad de aguas, no solo por la sensibilidad, sino también por la precisión intrínseca de estos métodos. En este trabajo se han llevado a cabo tres ensayos: i) Puesta a punto de metodologías de extracción de ADNg, para las matrices analizadas: agua de mar y aguas residuales; ii) Diseño de sondas específicas para la identificación de microorganismos indicadores de contaminación; iii) Análisis filogenético de las secuencias obtenidas a partir de las sondas específicas. Los principales grupos bacterianos, incluidos en la legislación vigente: Escherichia coli, Enterococcus intestinalis, Salmonella spp. y Legionella spp., han sido analizados en aguas de playa y en aguas residuales procedentes del humedal de biorremediación de Campus Universitario de Tafira (ULPGC). Los géneros Shigella spp. y Citrobacter spp., también se han determinado por su correlación con afecciones sobre la salud. La sondas específicas han sido diseñada en base a la región 16s rRNA. La amplificación de los fragmentos se llevó a cabo mediante PCR convencional. Las secuencias obtenidas fueron analizadas en profundidad en la base de datos NCBI mediante la herramienta genómica BLAST. El análisis filogenético fue confirmado con el software MEGA v 6.06, con el fin de generar los correspondientes árboles filogenéticos. Los resultados han revelado la especificidad de las sondas testeadas para cada uno de los organismos diana. Se discute el desarrollo de técnicas moleculares que optimicen aún más el coste de tiempo de diagnóstico y la proporción de resultados cuantitativos. Se concluye en primer lugar que los resultados obtenidos suponen un avance en la valoración de calidad de aguas de los entornos costeros como nuestras islas, siendo la base de trabajos futuros que ahondarán en el perfeccionamiento de obtención de diagnósticos tempranos. En segundo lugar con los resultados obtenidos se resalta la puesta en valor de las técnicas moleculares para la mejora, avance y optimización del monitoreo de la calidad de aguas, mediante la determinación molecular de los microorganismos indicadores propuestos en este trabajo.

This research proposes the establishment of new methodologies based on the genome of microorganisms, to control quality water, an aspect that will combine both the science and the management knowledge as addressed in Directive 2006/7/EEC concerning the quality management of the bathing waters. Monitoring the quality of the recreational seawater use is mainly carried out by biochemical techniques with a high time consuming. The development of molecular techniques, specially the design of specific probes to determine microorganisms, has enabled the optimization of the validation process of water quality, not only for the sensitivity, but also by the inherent accuracy of these methods. In this work three attempts were carried out i) Setting up gDNA extraction methods for two the matrix analyzed: seawater and sewage; ii) Design of specific probes to identify pollution indicator microorganisms; iii) Phylogenetic analysis of the sequences obtained from the specific probes. Main bacterial groups, included in the current legislation: Escherichia coli, Enterococcus intestinalis, Salmonella spp. and Legionella spp., have been analyzed in beaches and in waste water from wetland bioremediation of Tafira University Campus (ULPGC). The genus Shigella spp. and Citrobacter spp. were also determined by their correlation with health conditions. The specific probes were designed based on the 16S rRNA region. The amplification of fragments was carried out by conventional PCR. The sequences obtained were deeply analyzed in the NCBI database through the BLAST genomic tool. Phylogenic analysis was confirmed with MEGA v 6.06 software in order to generate the corresponding phylogenetic trees. The results revealed the specificity of the probes tested for each of the target organisms. The development of molecular techniques to optimize even more the time-cost of diagnoses and obtaining quantitative results is discussed. We conclude first that the results represent an advance in the assessment of water quality of coastal environments as our islands, being the basis for future work for further investigation on the optimization of the time-cost of early diagnosis. Secondly, with the results obtained the enhancement of molecular techniques for improvement, advancement and optimization of monitoring water quality is highlighted by the molecular determination of microorganisms proposed in this work.