Enzyme assays in assessing respiratory metabolism in marine plankton: the development of a new CO2-production proxy and further applications of respiratory enzymatic assays in oceanography

Abstract

Para cuantificar adecuadamente el papel del océano como posible sumidero del CO2 atmosférico, es necesario conocer tanto las tasas de producción primaria de los organismos autótrofos (fijación de CO2), como las de respiración (producción de CO2, RCO2). La RCO2 es particularmente difícil de medir, siendo generalmente calculada a partir de mediciones de consumo de O2 (RO2) tras la aplicación de cocientes respiratorios (RQ) y, especialmente en el océano profundo, de los ratios RO2/Φ. Debido a la variabilidad de ambos coeficientes, esta tesis está centrada en el desarrollo de un nuevo método que facilite una medición más directa de RCO2 en toda la columna de agua: la enzima isocitrato deshidrogenasa dependiente del NADP+ (NADP-IDH). Para ello, se han determinado las concentraciones de sus substratos y cofactores y las condiciones que permitan alcanzar la máxima actividad en muestras de la comunidad planctónica. Sin embargo, al calcular la capacidad máxima de producción de CO2 del organismo debemos tener en cuenta que la NADP-IDH no es la única enzima productora de CO2. Por ello, hemos estudiado su relación con las principales enzimas involucradas y, normalizando sus actividades por la NADP-IDH, calculamos la máxima producción de CO2 en la célula basada en la medición de la NADP-IDH (ΨNADP). Estos resultados fueron validados comparándolos con valores de RCO2 calculados a partir de Φ y distintos RO2/Φ y RQs utilizasdos en la literatura. Asimismo, gracias a la experimentación con distintas comunidades de Leptomysis lingvura pudimos comparar de manera directa la actividad de NADP-IDH con medidas de RCO2. Finalmente, hemos querido destacar el valor de estas medidas como indicadores del metabolismo catabólico de la comunidad planctónica. Para ello, ahondamos en el desarrollo del ratio Φ /Chl_a que permitió la monitorización de los cambios metabólicos en la comunidad microplanctónica durante el experimento KOSMOS GC 2014, dentro del proyecto BIOACID.

The anthropogenic CO2 emissions have been increasing for the past 250 years. Oceans are estimated to take up nearly one third of this CO2. However, proper assessment and understanding of the processes controlling these carbon fluxes requires, among other factors, quantifying primary production rates (CO2 fixation) and respiration rates (CO2 production, RCO2). Direct RCO2 measurements are not always feasible. Often they have to be calculated from O2 consumption (RO2). To do so, respiratory quotients (RQ), reported to be variable, are needed. In addition, when assessed from potential respiration (F), RO2/F ratios are also needed. In order to reduce the variability linked to the use of these ratios and quotients, this thesis is focussed on developing a more direct assessment of RCO2 throughout the water column. It aims to develop and use an assay for NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase (NADP-IDH) in marine plankton. In the development process, we determined the NADP-IDH optimum concentrations of substrate and cofactors, the optimum pH, and the proper treatment conditions needed to attain the NADP-IDH maximum velocity (Vmax). Unfortunately, NADP-IDH is not the only CO2-producing enzyme in the cells. Thus, we also assessed the relationship between the NADP-IDH and the other CO2-producing enzymes. After normalising their activities per NADP-IDH, we were able to develop a model to predict the potential CO2 production in marine plankton based on NADP-IDH measurements (YNADP). These results were validated by comparison with RCO2 values calculated from F, after applying different RO2/F ratios and RQs. YNADP always exceeded RCO2. This is consistent with the theoretical arguments that any physiological response should never exceed the potential activity controlled by the underlying enzymology.