Efectos moleculares y fisiológicos del extracto polifenólico de hoja de mango (Zynamite®) sobre la fatiga muscular y la respiración mitocondrial durante el ejercicio y la isquemia-reperfusión en seres humanos.

Abstract

ESP Introducción Esta tesis fue inicialmente diseñada para determinar los efectos moleculares de la ingesta oral de Zynamite®, un extracto polifenólico rico en mangiferina y quercetina, sobre la señalización muscular en condiciones basales y en respuesta al ejercicio en seres humanos. Dado que los dos principales compuestos de Zynamite® son potentes antioxidantes y moduladores de las principales enzimas implicadas en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) durante el ejercicio, primero estudiamos cómo se regula el equilibrio redox en el músculo esquelético humano, con énfasis en la Ca2+/calmodulina proteína cinasa II (CaMKII) y el factor nuclear eritroide similar al factor 2 (Nrf2). Por ello la tesis comienza con una revisión centrada en Nrf2 (Estudio 1), un factor de transcripción pleiotrópico activado principalmente por ROS. Seguidamente, se llevó a cabo un estudio metodológico centrado en la optimización de la detección de las isoformas de CaMKII en el músculo esquelético humano (Estudio 2). El siguiente estudio aborda los efectos del entrenamiento de fuerza sobre la expresión basal de las isoformas de CaMKII (Estudio 3). El cuarto estudio se centra en la regulación de la autofagia durante el ejercicio agudo de alta intensidad y la isquemia en el músculo esquelético humano (Estudio 4). Finalmente, el último estudio se centra en el principal tema de la tesis, que inspiró su título (Estudio 5). La mayoría de las enfermedades crónicas, el cáncer, la inflamación, la mutagénesis, las enfermedades neurodegenerativas y los procesos de envejecimiento se caracterizan por niveles elevados de ROS, que causan estrés oxidativo. Varias situaciones, incluido el ejercicio, aumentan la producción de ROS. Si bien los niveles excesivos de ROS pueden causar daño celular, el ejercicio regular mejora la capacidad antioxidante del músculo esquelético, mitigando el daño inducido por ROS y contribuyendo a las respuestas adaptativas. Nrf2 se activa principalmente por los niveles elevados de ROS y orquesta la respuesta adaptativa al estrés oxidativo durante el ejercicio, principalmente al mediar la transcripción de genes antioxidantes. CaMKII es una proteína inducida por las ROS y los cambios rápidos de concentración de calcio (Ca2+), que regula el fenotipo muscular, la biogénesis mitocondrial, la autofagia y la señalización antioxidante. La caracterización precisa de las isoformas de CaMKII (δD, γ/δ y βM) en el músculo esquelético humano es fundamental para comprender sus funciones específicas y respuestas al ejercicio. Por lo tanto, en el Estudio 2, desarrollamos un análisis de inmunoblotting basado en la incubación de extractos musculares con varios anticuerpos dirigidos contra isoformas específicas de CaMKII para facilitar la identificación de aquellas que responden más al ejercicio y a Zynamite PX®. En un tercer estudio (Estudio 3), determinamos si la expresión basal de CaMKII depende del nivel de fatiga provocado durante el programa de entrenamiento de fuerza y si los cambios de CaMKII con el entrenamiento estaban asociados con las respuestas adaptativas de la masa muscular (hipertrofia), la composición muscular de las cadenas pesadas de miosina (MHC) y la expresión de proteínas mitocondriales (OXPHOS). El Estudio 3 también evaluó si la sarcolipina (SLN) cambia con el entrenamiento de fuerza. La sarcolipina es una proteína que, cuando se sobreexpresa, disminuye el acoplamiento de Ca2+ a la Ca²⁺-ATPasa del retículo sarcoplásmico/endoplásmico (SERCA), lo que resulta en un aumento del gasto energético, estrés oxidativo, cambio de tipo de fibra muscular de rápida a lenta y la biogénesis mitocondrial. La producción excesiva de ROS puede causar estrés oxidativo y daño celular, lo que puede afectar la función celular. La autofagia es un proceso celular que degrada componentes dañados y proteínas mal plegadas. Es esencial para mantener la salud muscular y es necesario para una respuesta adaptativa fisiológica al ejercicio. En el músculo esquelético se han descrito dos tipos principales de autofagia: la macroautofagia y la autofagia mediada por chaperonas (CMA). La macroautofagia es un proceso en el que vesículas de doble membrana denominadas autofagosomas, capturan y degradan orgánulos y proteínas dañados para mantener la homeostasis celular. La autofagia mediada por chaperonas es un proceso similar que implica la degradación selectiva de proteínas con una secuencia específica reconocidas por proteínas chaperonas, que luego son transportadas al lisosoma para su degradación. Se desconoce cómo se regulan las vías de señalización de la autofagia con el ejercicio agudo hasta el agotamiento y cómo diferentes niveles de oxigenación muscular y acumulación de metabolitos en el músculo esquelético humano influyen en la macroautofagia y la CMA (Estudio 4). Para este propósito, hombres sanos realizaron un ejercicio incremental hasta el agotamiento (IE) en normoxia e hipoxia, seguido de aplicación inmediata de isquemia. Se tomaron biopsias del vasto lateral. El objetivo principal fue determinar la señalización de autofagia en el músculo esquelético en respuesta al IE con diferentes niveles de presión parcial inspiratoria de oxígeno (PIO2) e isquemia. Además, se analizó la regulación de FOXO, Akt-mTOR y GSK3β bajo estrés metabólico elevado y su influencia en la señalización de autofagia muscular. Los polifenoles naturales y las xantonas, como la mangiferina y la quercetina, poseen propiedades antioxidantes y antiinflamatorias que pueden mejorar el rendimiento físico al inducir la señalización mediada por Nrf2, neutralizar los radicales libres e inhibir la xantina oxidasa (XO) y la NADPH oxidasa (NOX), las principales enzimas productoras de ROS durante el ejercicio. Zynamite®, un extracto de hojas de mango rico en mangiferina, ha sido estudiado en combinación con diferentes formulaciones, demostrando su capacidad para mejorar el rendimiento físico y acelerar la recuperación tras el daño muscular inducido por el ejercicio (EIMD). Sin embargo, ningún estudio en humanos ha determinado si Zynamite PX®, un extracto polifenólico que combina el extracto de hojas de mango con quercetina, ejerce efectos sobre la señalización muscular en el músculo esquelético en reposo y en respuesta a ejercicios de alta intensidad, con o sin isquemia-reperfusión posterior al ejercicio (Estudio 5). Materiales y métodos En el marco de esta tesis, se realizaron cuatro estudios experimentales (estudios 2-5) en los que se utilizó Western Blot como técnica principal para evaluar la expresión de proteínas en biopsias de músculo esquelético de hombres jóvenes y sanos. Los extractos musculares se prepararon con ~10 mg de tejido triturado con bolas de acero inoxidable y homogeneizado en un tampón de lisis con urea y cócteles inhibidores de proteasas y fosfatasas. Estudio 1: Este artículo es una contribución a la edición especial titulada "Desbloqueando el potencial atlético: explorando la fisiología del ejercicio desde los mecanismos hasta el rendimiento" de la revista Free Radical Biology & Medicine de 2024. Para realizar esta revisión, se buscaron todos los artículos que contenían los términos en "Nrf2", "Keap1" y "skeletal muscle" en Web of Science (WOS). Además, se realizó una búsqueda con los términos " glutathione " y "skeletal muscle". Se llevaron a cabo búsquedas adicionales basadas en las referencias citadas en estos artículos si no habían sido identificadas previamente. Estudio 2: Este estudio fue diseñado para optimizar la detección de las diferentes isoformas de CaMKII mediante Western blot, stripping y reincubado utilizando ocho anticuerpos comerciales diferentes de CaMKII en músculo esquelético humano. Se utilizó músculo esquelético humano de un participante sano obtenido en condiciones de reposo para incubar con los siguientes anticuerpos: Aldrich oxidado-Met281/282 (no. 07-1387, Sigma Aldrich), CST pThr287 (no. 12716, Cell Signaling Technology), BD Total (no. 611292, BD Biosciences), CST Total (no. 4436, Cell Signaling Technology), Abcam δ (no. 181052, Abcam), Badrilla δ (no. A010-55AP, Badrilla), Proteintech γ (no. 12666-2-AP, Proteintech), SCBT β (no. 376828, Santa Cruz Biotechnology). Como ensayo adicional para validar el patrón de bandas, se obtuvieron biopsias del músculo vasto lateral antes y después de una intervención de entrenamiento de fuerza de 3 sujetos 1 y antes y después de una sesión de ejercicio agudo de alta intensidad de 1 sujeto 2, las cuales se incubaron (pThr287-CaMKII y ox-Met281/282-CaMKII, respectivamente), seguidas de stripping y reincubado con el anticuerpo para CaMKII total. Se utilizaron las herramientas de Análisis de bandas y peso molecular del software Image Lab© 6.0.1 (Bio-Rad) para determinar los pesos moleculares experimentales. Estudio 3: Este estudio fue una extensión de un estudio previo 3. El objetivo de este estudio fue determinar si CaMKII y SLN estaban involucrados en los cambios de fenotipo y rendimiento muscular provocados por el entrenamiento de fuerza. Para este propósito, 22 hombres jóvenes siguieron un programa de entrenamiento de fuerza basado en la velocidad durante 8 semanas utilizando el ejercicio de sentadilla completa mientras se monitorizaba la velocidad de ejecución de las repeticiones. Los sujetos fueron asignados aleatoriamente a dos programas de entrenamiento de fuerza que diferían en la pérdida de velocidad de repetición permitida en cada serie: 20% (VL20) vs 40% (VL40). Se tomaron biopsias del vasto lateral antes y después del entrenamiento. La expresión de proteínas de CaMKII, SLN y OXPHOS se determinó mediante Western blot. Los datos previamente publicados 3 sobre las mejoras en la fuerza máxima (1RM), el rendimiento en salto vertical, el número de repeticiones realizadas durante el programa de entrenamiento, el grado de hipertrofia muscular y el cambio en el porcentaje de cadena pesada de miosina IIx (MHC-IIx) se utilizaron para la interpretación de las respuestas de señalización muscular. Los análisis estadísticos se realizaron mediante un ANOVA de medidas repetidas 2 x 2 con el software SPSS versión v.18 para Windows (SPSS Inc). Se aplicó un análisis de correlación de Pearson para determinar las asociaciones entre variables. Estudio 4: Esta investigación se realizó para determinar los cambios en la expresión proteica de las vías de señalización de macroautofagia y CMA después de ejercicio de alta intensidad y aplicación de isquemia post-esfuerzo incluidas las principales señales reguladas por Zynamite®. Se determinaron los marcadores de Forkhead box O (FOXO), los relacionados con la elongación proteica (GSK3β y EEF2), así como marcadores hipóxicos (HIF1α) y los involucrados en la síntesis de proteínas (Akt y mTOR). Para lograr estos objetivos, 11 hombres realizaron un ejercicio incremental hasta el agotamiento en normoxia (Nx, PIO2:143 mmHg) e hipoxia (Hyp, PIO2:73 mmHg, AltiTrainer200), en orden aleatorio. Al agotamiento, la circulación de una pierna se ocluyó instantáneamente durante 60 s con un inflador rápido (300 mmHg, Hokanson) conectado a un manguito (SC10D Hokanson) mientras los sujetos eran trasladados cuidadosamente a una camilla. Se tomaron biopsias del vasto lateral antes (Pre), 10 s después (Post, solo pierna ocluida) y 60 s después del IE en las piernas ocluida (Oc1m) y no ocluida (FC1m). Las biopsias de FC1m solo se tomaron después de la prueba hipóxica, obtenidas de la pierna que se estaba recuperando con circulación libre en normoxia durante 60 s. El consumo de oxígeno se midió respiración a respiración utilizando un carro metabólico (Vmax N29; Sensormedics, Yorba Linda, CA, EE. UU.). Los metabolitos musculares se evaluaron y reportaron previamente 4. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un ANOVA de medidas repetidas 3 x 2. Se compararon las piernas ocluidas y no ocluidas utilizando una prueba t pareada de dos colas. Se determinaron las asociaciones lineales entre proteínas aplicando un modelo mixto lineal. Se calculó la prueba de razón de verosimilitudes para los efectos aleatorios (LRT) junto con los valores de R-cuadrado marginal y condicional. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software IBM SPSS, v.29.0, para Mac (IBM, Nueva York, NY, EE. UU.) y Jamovi v2.4.8. (The jamovi project 2023). Estudio 5: Esta investigación fue diseñada para determinar los efectos de 48 h de suplementación con Zynamite PX® sobre los niveles de Nrf2 en músculo esquelético y la señalización inducida por Nrf2 en condiciones basales y en respuesta al ejercicio de alta intensidad combinado con isquemia-reperfusión en humanos. También se determinaron las principales proteínas reguladoras de los niveles de Nrf2, denominadas, CaMKII, GSK3β, p38 MAPK y Keap1, así como la expresión proteica de las enzimas antioxidantes GR y catalasa. Para ello, 25 hombres jóvenes (17 grupo Control; 8 grupo Zynamite PX®) realizaron un ejercicio incremental (IE) hasta el agotamiento, seguido de oclusión instantánea unilateral de la pierna durante 60 s con un inflador rápido (300 mmHg, Hokanson) conectado a un manguito (SC10D Hokanson). Al liberar el manguito, los sujetos realizaron un sprint máximo de 30 s (prueba de Wingate) con el ergómetro configurado en modo isocinético (80 RPMs), y posteriormente, la misma pierna fue ocluida instantáneamente durante 90 s. Inmediatamente después de la oclusión, los sujetos fueron trasladados cuidadosamente a una camilla, donde descansaron en posición supina mientras la circulación de la pierna biopsiada permanecía completamente ocluida durante los 90 s. La suplementación consistió en 140 mg de Zynamite® (estandarizado al 60% de mangiferina, un extracto acuoso de Mangifera indica) en combinación con 140 mg de quercetina (proporcionada como 280 mg de extracto de Sophora japonica, estandarizado al 50% de quercetina), comercializado como Zynamite PX®, cada 8 h para un total de seis dosis 48 h antes de la biopsia en reposo. Se ingirió una última dosis del suplemento ~60 min antes del inicio del ejercicio. Se tomaron biopsias del vasto lateral en reposo (antes de ingerir la última dosis de Zynamite PX®, Pre – B1), 20 s después del IE (Post, pierna ocluida – B2) y 10 s después de Wingate (OcW, pierna ocluida – B3), y de la pierna ocluida y no ocluida a los 90 s (Oc90 y nOc90 – B4) y 30 min post-Wingate (Oc30m y nOc30m – B5). El consumo de oxígeno se midió respiración a respiración utilizando un carro metabólico (Vyntus, Jaeger-CareFusion, Höchberg, Alemania). Se utilizó una prueba t de dos colas no apareada para estudiar los cambios en la expresión de proteínas en condiciones de reposo entre el grupo suplementado y el grupo de control. Una prueba t apareada evaluó las diferencias entre la piernas isquémica y de libre circulación a los 90 s y 30 min post-ejercicio. Debido a respuestas similares en ambas piernas en cada punto temporal, se promediaron las biopsias a los 90 s, al igual que las biopsias a los 30 min, y estos promedios se utilizaron para representar las respuestas post-ejercicio a los 90 s y 30 min, respectivamente. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un ANOVA de medidas repetidas 5 x 2 con el software IBM SPSS, v. 29.0, para Mac (IBM, Nueva York, NY, EE. UU.). Resultados El Estudio 1 ofrece una visión general del rol de Nrf2 en la mejora del rendimiento y de las adaptaciones al entrenamiento en humanos. La señalización de Nrf2 se activa principalmente en respuesta al desequilibrio redox por ROS o electrófilos en el músculo esquelético 5 , 6. Estudios en ratones knockout para Nrf2 (Nrf2-/-) reportaron menos fuerza y mayor fatigabilidad debido a una menor capacidad respiratoria mitocondrial basal y adaptabilidad mitocondrial al entrenamiento 7. En humanos, la expresión basal de Nrf2 en músculo esquelético se ha asociado con el consumo máximo de oxígeno (VO2máx) 8 y el rendimiento en ejercicios de alta intensidad 9, 10. Durante el ejercicio, los ROS se producen principalmente por NOX2 y XO 11-13, así como por la cadena de transporte de electrones mitocondrial. La contribución de cada fuente de ROS varía con la intensidad del ejercicio, duración, oxidación de sustratos, estado de entrenamiento, oxigenación, nivel de fatiga y edad 11, 14-16. Los ROS son contrarrestados por antioxidantes enzimáticos, como las superóxido dismutasas (SODs), glutatión reductasa (GR), catalasa, glutatión peroxidasa (GPx) y antioxidantes no enzimáticos. El radical superóxido (O2-) es reducido a peróxido de hidrógeno (H2O2) por las SODs. El peróxido de hidrógeno, que es un oxidante menos reactivo, es reducido por catalasa y GPx. La actividad enzimática de GPx consume glutatión reducido (GSH) y produce glutatión oxidado (GSSG), siendo el ratio GSH:GSSG un indicador teórico de la capacidad de tamponamiento redox 17. No obstante, los estudios que evalúan el ratio GSH:GSSG en el músculo esquelético humano muestran alta variabilidad, lo que indica que podría no ser un biomarcador fiable de la capacidad de tamponamiento antioxidante de la célula a menos que se mida con precisión 18. En condiciones basales, Nrf2 forma un complejo con Keap1 19, 20, que actúa como proteína adaptadora facilitando la acción de un complejo E3 ubiquitina ligasa (CUL-E3), el cual ubiquitina a Nrf2 20. Esto provoca la disociación de Nrf2 y Keap1 y la posterior degradación proteasomal de Nrf2 ubiquitinado 21, 22. Ante el estrés oxidativo, los ROS modifican a Keap1, deshabilitando su función adaptadora para CUL E3, impidiendo la ubiquitinación de Nrf2 21, 23, 24 y estabilizando el complejo Keap1-Nrf2. El primer Nrf2 recién sintetizado es secuestrado por Keap1 libre restante, y solo cuando Keap1 libre se agota, Nrf2 transloca al núcleo 19, 25, donde se une a los elementos de respuesta antioxidante (AREs) para activar la expresión de enzimas antioxidantes 7, 26-32. Además, la degradación de Keap1 también es mediada por sequestosoma 1 (p62/SQSTM1), que se une directamente a Keap1 a través de una secuencia específica, la región de interacción con Keap1 (KIR) 2, 33, 34, lo que lleva a la degradación lisosomal de Keap1 y promueve la señalización de Nrf2 35. La regulación de Nrf2 durante el estrés oxidativo también puede ser independiente de Keap1. La retención nuclear de Nrf2 está modulada por múltiples sitios de fosforilación de Nrf2, que son regulados por quinasas inducidas por el ejercicio, como p38 MAPK en pSer40-Nrf2 36, 37. Adicionalmente, la regulación al alza de las quinasas inducidas por el ejercicio (AMPK, Akt, PKA y PKC) 38-40 puede producir una disminución en la actividad de GSK3β, lo que atenúa la fosforilación de Nrf2 en Ser338 y Ser342, impidiendo la degradación de Nrf2 por el proteasoma. La inhibición de GSK3β también puede facilitar la retención nuclear de Nrf2 al impedir la fosforilación de Nrf2 en Ser344 y Ser347 41-43 y en Ser550 44. Además, el peróxido de hidrógeno y el sulforafano pueden estimular la traducción de Nrf2 cap-independiente a través de un sitio interno de entrada del ribosoma (IRESNrf2) 45, 46, un proceso que requiere la fosforilación del factor de iniciación eucariota 2 alfa (eIF2α) por quinasas inducidas por estrés 47-49. La acetilación de Nrf2 promueve la translocación nuclear 50. La exportación nuclear y la posterior ubiquitinación y degradación son facilitadas por la quinasa Fyn al fosforilar a Nrf2 en Tyr568 51. Los polifenoles pueden reducir la disponibilidad de Keap1, mejorar la translocación nuclear de Nrf2, inducir la transcripción y traducción de Nrf2 46, 52, y reducir la degradación proteasomal de Nrf2 52. Aunque se ha sugerido que la ingesta de antioxidantes antes del ejercicio puede atenuar algunas de las adaptaciones al ejercicio, esto sigue siendo controvertido en humanos sanos 53 y solo se puede observar después de la ingesta de altas dosis de vitamina C y E 54, 55. En cambio, se considera que la ingesta de polifenoles derivados de frutas es positiva para mejorar el rendimiento y la recuperación en atletas 56. El Estudio 2 determinó los pesos moleculares de las isoformas de CaMKII en músculo esquelético humano en función de la movilidad en SDS-PAGE, que corresponden a: δD, con 54.2 ± 2.1 kDa; γ/δ, con 59.0 ± 1.2 kDa y 61.6 ± 1.3 kDa; y la isoforma βM, con 76.0 ± 1.8 kDa. También evaluamos la especificidad de los anticuerpos de CaMKII. El anticuerpo β CaMKII (no. 376828, Santa Cruz Biotechnology) reconoció una sola banda, alineada con el peso molecular (MW) correspondiente a una banda similar marcada por los anticuerpos dirigidos contra CaMKII total, fosfo- y oxidada. Además, el anticuerpo δ CaMKII (no. 181052, Abcam) mostró alta especificidad para δD, la isoforma más sensible a ROS y a gradientes de Ca2+ intracelular en el músculo esquelético humano. Por el contrario, el anticuerpo γ CaMKII (no. 12666-2-AP, Proteintech) mostró reactividad cruzada con todas las isoformas de CaMKII, lo que no permitió distinguir entre las isoformas γ/δ. El Estudio 3 mostró que la cantidad de fatiga permitida en cada serie de la intervención de entrenamiento de fuerza determinó los niveles de CaMKII basal, la expresión basal de SLN y los cambios en el fenotipo muscular. El entrenamiento de fuerza provocó hipertrofia muscular, mejoró el 1RM e incrementó CaMKII total, principalmente por un aumento de la CaMKII δD total. El grupo que entrenó con mayor fatiga intra-serie (VL40) experimentó mayor hipertrofia muscular y reducción del porcentaje de MHC-IIx (lo que podría limitar la mejora de la potencia muscular con el entrenamiento) y un aumento de la fosforilación de CaMKII δD en Thr287. En contraste, el grupo que entrenó con menor fatiga intra-serie (VL20) incrementó la expresión de SLN y atenuó el cambio de MHC-IIx a IIa sin variaciones en la fosforilación de CaMKII. Los cambios en los niveles de fosforilación de CaMKII δD en Thr287 se asociaron positivamente con la hipertrofia muscular y el número de repeticiones durante el entrenamiento, y negativamente con los cambios en MHC-IIx. La expresión de SLN no se asoció con cambios en la hipertrofia muscular, el porcentaje de MHC-IIx, el número de repeticiones ni las mejoras en el rendimiento del salto vertical y 1RM, mientras que se asoció negativamente con pThr287-CaMKII δD, SDHB (Complejo II) y ATP5A (Complejo V). La mayoría de las proteínas de OXPHOS permanecieron sin cambios, excepto NDUFB8 (Complejo I), que se redujo después del entrenamiento en ambos grupos. No se observó ninguna asociación entre pThr287-CaMKII y OXPHOS, lo que indica que una mayor activación de CaMKII no indujo la expresión de proteínas mitocondriales. El Estudio 4 mostró que un ejercicio incremental hasta el agotamiento seguido de la aplicación de isquemia durante 60 s indujo la macroautofagia y autofagia mediada por chaperonas de manera similar en normoxia (Nx) e hipoxia (Hyp). Bajos niveles del ratio AMP:ATP y el estrés metabólico activaron la señalización de la macroautofagia a través de AMPKα-UKL1. Esto fue seguido por la fosforilación en Ser15 de BECN1, crucial para la formación del fagóforo. Los niveles elevados de pSer349-SQSTM1/p62, la reducción de SQSTM1/p62 total y una mayor proporción de la ratio LC3B-II:LC3B-I sugirieron un aumento de la degradación de autofagosomas. Esta señalización fue acompañada por el aumento de PHAF1/MYTHO, un nuevo biomarcador de macroautofagia, que se asoció positivamente con la ratio LC3B-II:LC3B–I. El aumento de LAMP2A indicó la activación de la autofagia mediada por chaperonas en respuesta al ejercicio agudo de alta intensidad, independientemente de la disminución post-ejercicio de HSPA8/HSC70. Además, pSer40-Nrf2 y LAMP2A se asociaron positivamente, lo que sugiere una estimulación de CMA dependiente de ROS. Los FOXOs no parecieron regular la macroautofagia y CMA en músculo esquelético sano, ya que su señalización fue inhibida después del ejercicio de alta intensidad. La disminución de pThr56-EEF2, que está inhibido por EEF2K, indicó una disminución de la señalización de elongación proteica después del ejercicio. EEF2K es activado por AMPKα activa y GSK3β. Además, la disminución de la activación de Akt podría indicar una disminución de la síntesis de proteínas bajo un alto estrés metabólico. El aumento de hidroxi-Pro564 HIF1α en condiciones de ejercicio en normoxia no fue más estimulado por la hipoxia o la isquemia. La asociación positiva entre pSer571-PGC1α y pThr172-AMPKα sugirió un aumento de la biogénesis mitocondrial y de la transcripción de genes de macroautofagia. A pesar de una mayor activación del metabolismo glucolítico, la hipoxia severa no exacerbó la respuesta de señalización de la autofagia, lo que indica que los niveles de autofagia fueron casi máximos con el ejercicio en normoxia. La mayoría de los cambios de señalización revirtieron en un minuto de recuperación con circulación libre, mientras que la aplicación inmediata de isquemia post-ejercicio impidió la recuperación. El Estudio 5 demostró que, en comparación con los controles, el grupo suplementado con Zynamite PX® aumentó la expresión basal de pThr287-CaMKII δD, que fosforila GSK3β en Ser9, inhibiendo su actividad. El aumento de la inhibición de GSK3β puede disminuir la tasa de degradación proteasomal de Nrf2, y, en consecuencia, se observó un aumento no significativo de Nrf2 total (p = 0.099) y pSer40-Nrf2 (p = 0.061). No se observaron cambios basales en las enzimas antioxidantes (catalasa y GR), lo que sugiere que se podrían necesitar dosis más altas o que el sistema enzimático antioxidante está estrictamente regulado. En el grupo de control, el ejercicio combinado con isquemia-reperfusión y recuperación condujo a la activación de quinasas de estrés (pThr287-CaMKII δD y pThr180/Tyr182-p38 MAPK) y a la respuesta de señalización antioxidante (Nrf2 total, Nrf2/Keap1, catalasa y GR). Sin embargo, esta señalización fue parcialmente atenuada en el grupo Zynamite PX®, lo que sugiere que Zynamite PX® puede reducir el estrés metabólico y la señalización inducida por ROS aumentando la señalización basal de Nrf2 después de la ingesta de Zynamite PX®.

Conclusiones La regulación del factor de transcripción Nrf2 en el músculo esquelético durante el ejercicio involucra una interacción entre el equilibrio redox, el estrés celular y las respuestas adaptativas. Nrf2 activa la expresión de varias enzimas y vías antioxidantes en respuesta al estrés oxidativo y se regula a través de Keap-1 y de varias modificaciones postraduccionales que controlan su localización nuclear, traducción proteica y degradación proteasomal, de manera independiente de la regulación mediada por Keap1. Además, los polifenoles dietéticos han emergido como moduladores potenciales de la actividad de Nrf2 (Estudio 1). Los pesos moleculares de las isoformas de CaMKII caracterizadas por immunoblotting son: 54.2 ± 2.1 kDa (δD), 59.0 ± 1.2 kDa, 61.6 ± 1.3 kDa (γ/δ) y 76.0 ± 1.8 kDa (βM), siendo la δD la más responsiva a ROS y gradientes de Ca2+ (Estudio 2). CaMKII δD total aumenta en respuesta al entrenamiento de fuerza, y realizar repeticiones cerca del fallo dentro de cada serie se asocia con niveles basales elevados de pThr287-CaMKII δD. El aumento de pThr287-CaMKII δD se asocia positivamente con la hipertrofia muscular y negativamente con los cambios en la expresión de MHC-IIx. La expresión de sarcolipina aumenta en respuesta al entrenamiento de fuerza, pero este efecto solo se observa cuando el nivel de fatiga en la serie es bajo. Se ha demostrado una asociación inversa entre los cambios basales de pThr287-CaMKII δD y los de sarcolipina, lo que es compatible con la existencia de un loop negativo que limita una expresión excesiva de SLN después de contracciones musculares fatigantes (Estudio 3). Los niveles de macroautofagia y CMA son aumentados de manera similar durante el ejercicio hasta el agotamiento en normoxia e hipoxia severa. Los ROS producidos durante el ejercicio incremental y la isquemia pueden activar la macroautofagia y la CMA, pero no los FOXOs. Hay una mayor expresión del nuevo biomarcador de autofagia PHAF1/MYTHO en el músculo esquelético humano en respuesta al ejercicio en normoxia, hipoxia e isquemia post-ejercicio. Hay una activación concurrente de la autofagia con la inhibición de la elongación y síntesis proteica (Estudio 4). La ingesta oral de Zynamite PX® aumenta los niveles basales de pThr287-CaMKII δD y de la fosforilación inhibidora de GSK3β en el músculo esquelético humano, lo que puede provocar adaptaciones musculares similares a las inducidas por el ejercicio. Consecuentemente, la respuesta de las quinasas de estrés inducidas por el ejercicio y la isquemia-reperfusión se atenuó parcialmente después de la suplementación con Zynamite PX®. Esto puede explicarse por 1) la mejora de la señalización de Nrf2 antes del ejercicio por la suplementación de Zynamite PX® durante 48 h y 2) la dosis de Zynamite PX® tomada 60 min antes del ejercicio, que puede haber contribuido a atenuar parte de la respuesta de señalización de Nrf2/ROS inducida por el ejercicio (Estudio 5). En general, esta tesis proporciona valiosos conocimientos sobre la regulación redox y los efectos de Zynamite PX® en el músculo esquelético humano. Este conocimiento es de gran interés para identificar nuevas dianas terapéuticas para contrarrestar las enfermedades derivadas de ROS y las lesiones isquémicas. También ofrece conocimientos moleculares sobre cómo los polifenoles regulan la señalización del músculo esquelético, lo que puede resultar útil para desarrollar nuevas aplicaciones para Zynamite PX®.