Immune response of Canaria Hair Breed (Chb) and Canaria Sheep (Cs) Vaccinated Against Teladorsagia Circumcincta

Abstract

1. INTRODUCCIÓN El parasitismo causado por Teladorsagia circumcincta y otros nematodos gastrointestinales tiene un gran impacto en el sector ganadero de pequeños rumiantes, causando pérdidas económicas que se ven agravadas por la resistencia que han generado estos a los fármacos. Debido al aumento exponencial de la población mundial hay una mayor demanda de alimento y, por tanto, es imprescindible mejorar la producción de forma sostenible y disminuir la aparición de parásitos resistentes. Esto ha conllevado a la búsqueda de métodos alternativos/complementarios al uso de químicos, como pueden ser el desarrollo de vacunas o la selección de animales/razas resistentes. En esta tesis se han combinado ambos métodos, contando con dos razas ovinas locales (Canaria -CAN- y Canaria de Pelo -CAP-) de las Islas Canarias (España), que han presentado diferente susceptibilidad a nematodos gastrointestinales con anterioridad, y con un prototipo vacunal frente a T. circumcincta que, aun presentando previamente cierta variabilidad individual, ha conferido protección. 2. OBJETIVOS Comparar la eficacia del prototipo vacunal frente a Teladorsagia circumcincta y la respuesta generada tras la inmunización en corderos de 6 meses de las razas locales Canaria y Canaria de Pelo de las Islas Canarias (España) que han sido inoculados experimentalmente con 2000 L3 de este parásito de forma seriada. Observar la resistencia a la infección por T. circumcincta en estas dos razas, comparando los datos parasitológicos de los grupos controles de ambas razas. 3. MATERIAL Y MÉTODOS Se utilizaron 46 corderos de 6 meses de edad de las razas CAN y CAP, estableciéndose un grupo vacunado y otro control de cada raza. A los grupos vacunados se les administró el prototipo vacunal y a los controles sólo el adyuvante. Las inmunizaciones se llevaron a cabo cada 3 semanas (3 vacunaciones en total), seguidas de 3 inoculaciones orales semanales de 2000 L3 de T. circumcincta durante 4 semanas. Se recogieron muestras de heces periódicamente para el recuento de huevos del parásito. Posteriormente, se sacrificaron los animales y se recolectó el contenido abomasal de cada uno para determinar la carga parasitaria, medir la longitud de los vermes hembra y realizar el recuento de huevos en útero. Para analizar las IgA, IgG1 e IgG2 específicas frente a L3, L4 y adulto de T. circumcinta en suero mediante el ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (E.L.I.S.A.) se obtuvieron muestras de sangre a los 77 días después de la primera inmunización. Después del sacrificio, también se recogieron muestras de la región antropilórica del abomaso y linfonodos regionales. Las muestras de abomaso se usaron para su estudio histológico e inmunohistoquímico, consistiendo en el recuento de poblaciones celulares mediante técnicas de tinción (eosinófilos, mastocitos y leucocitos globulares) e inmunomarcaje (linfocitos CD4+, CD8+, +, -WC1+, CD45RA+, MHC-II+ y Galectina-14+) respectivamente. Los linfonodos abomasales, por su parte, se usaron para ensayos de estimulación linfocitaria. Esto se realizó con el objetivo de determinar las citoquinas IFN-, IL-6 e IL-17A específicas generadas frente a los antígenos parasitarios L3, L4 y adulto de T. cicrcumcincta mediante E.L.I.S.A. de captura; y, también, para realizar un fenotipado de las células producidas mediante citometría de flujo, todo esto realizado en los laboratorios del Moredun Research Institute (Edimburgo, Reino Unido). Asimismo, una muestra adicional de tejido abomasal de cada animal se recolectó y mantuvo en E.Z.N.A. RNA Lock Reagent (Omega Bio-tek) para su conservación y posterior extracción de ARN. De esta manera, se pudo estudiar la expresión génica en los corderos, al recolectarse los datos utilizando las siguientes bases de datos y herramientas de búsqueda: “Ovis aries Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes” (KEGG), “Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery” (DAVID), “Ensembl”, “Basic Local Alignment Search Tool” (BLAST), “Uniprot” y “GeneCards”. Por último, los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando diferentes programas: IBM SPSS Statistics version 24.0 para los datos parasitológicos, inmunológicos y recuento de poblaciones celulares en abomaso; RStudio con el paquete vers. 1.1.456 (R Core Team 2019) para el fenotipaje celular y determinación de citoquinas, además de para la realización de gráficas; y R vers. 3.4.4 (2018-03-15) con el paquete Bioconductor lima para observar las diferencias en la expresión génica de los animales. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Parasitología (Capítulo 1) La vacuna generó un efecto protector en la raza Canaria reduciendo de forma significativa la longitud de vermes hembra y huevos intraútero en el grupo vacunado cuando se comparaba con el grupo control. Por otra parte, parece que la raza Canaria de Pelo es más resistente a T. circumcincta que la raza Canaria, al contar, el grupo control, con parásitos de menor tamaño y con menor número de huevos en útero que los no vacunados de la raza Canaria, similar a lo observado anteriormente en inoculaciones simples experimentales con otro nematodo gastrointestinal, Haemonchus contortus. Respuesta inmune (Capítulo 2) La protección que generó la vacuna en la raza Canaria se asoció a dos inmunoglobulinas (IgA e IgG2) específicas frente al parásito, además de a los leucocitos globulares, observándose correlaciones negativas entre ellos y distintas variables parasitológicas. Además, asociándose también a esta protección, se observó un mayor ratio de CD4+/CD8+. Expresión génica (Capítulo 3) Muchos de los genes que se encontraron sobre expresados en los animales inmunizados de la raza Canaria se han asociado al control de nematodos. Se observaron genes relacionados con la sensibilización y activación de mastocitos, y genes que participan en la formación del mucus. Asimismo, se encontraron genes relacionados con el reconocimiento y captura de antígenos, además de con la producción de citoquinas e inmunoglobulinas. Y otros genes que podrían ejercer una acción directa sobre el nematodo. Los principales genes regulados a la baja en los vacunados estuvieron relacionados con algunos efectos negativos en caracteres productivos, aunque se desconoce su transcendencia al haberse observado en abomaso. Otros genes se relacionaron con la respuesta inmune. 5. CONCLUSIONES El prototipo vacunal frente a Teladorsagia circumcincta confirió protección en la raza ovina Canaria, asociándose a una mayor expresión de genes relacionados con la respuesta inmune orientada al control de nematodos, y relacionada con IgA e IgG2 específicas frente al parásito, leucocitos globulares y con un mayor ratio de CD4+/CD8+. La raza ovina Canaria de Pelo demostró una mayor resistencia a infecciones experimentales seriadas de Teladorsagia circumcincta que la raza Canaria.