Diseño y puesta a punto de una PCR múltiplex para el diagnóstico simultáneo del virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) y el virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (IHHNV), en el langostino blanco ("Litopenaeus vannamei")

Abstract

La industria del langostino blanco o camarón blanco, Litopenaeus vannamei, ha ido aumentando en las últimas décadas, a razón de millones de toneladas por año, convirtiéndose en el sector económico más importante de la economía mundial. Sin embargo, con el crecimiento de la industria también empezaron a emerger problemas con patógenos que representan grandes pérdidas económicas al año. De ahí, que la detección de ciertas enfermedades en los tanques de reproductores constituya una ventaja que puede reducir las pérdidas económicas anuales, a la vez que asegurar que la descendencia no contraiga los patógenos por vía transovárica. Los objetivos de este estudio han sido: el diseño de cebadores y sondas adecuadas para la detección del virus de la mancha blanca (WSSV) y el virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (IHHNV); la compatibilidad de las sondas de ambos patógenos bajo una reacción de amplificación simultánea; optimizar la temperatura de hibridación para todos los juegos de cebadores y sondas; medir la sensibilidad de la técnica para éstos y elaborar un protocolo unificado que funcione correctamente en la detección de los dos patógenos simultáneamente. Para ello, se han utilizado muestras de ADN de WSSV procedentes del centro de referencia CENIAQUA (Colombia) y de IHHNV de la empresa comercial BIOGEMAR S.A. (Ecuador). Como ADN de langostino blanco libre de patógenos se ha utilizado muestras de langostinos comerciales, provenientes del Ecuador y que son sometidos a la detección previa de dichos patógenos por parte del Instituto Nacional de Pesca (INP) antes de ser exportado. Estos últimos fueron utilizados para comprobar la falta de hibridación específica o la existencia de alguna hibridación inespecífica. En el diseño de los juegos de cebadores y sondas se consideró su compatibilidad, no sólo entre WSSV e IHHNV sino también de éstos con los juegos diseñados para otros patógenos de interés en el sector como son NHP Y MBV, al objeto de poder ser incorporadas a la reacción de diagnóstico en un futuro. Con todos los resultados obtenidos se ha elaborado un protocolo final que reúne las condiciones de temperatura y tiempo necesarias en cada ciclo, el número de ciclos, la cantidad de material genético recomendable a analizar y el diseño de cebadores y sonda requeridos para que funcione correctamente el test.

The industry of white shrimp, Litopenaeus vannamei, has been increased in the last decades, with a growth rate of millions of tons per year, being this economic sector the most important onewithin the world aquaculture. However, this growth brought associated problems with pathogens, representing actually important losses year. Thus the early detection of some diseases in broodstock􀍛s tanks is an advantage in order to reduce annual economic losses, and at the same time to ensure that offspring does not contract pathogens by transovaric route. The objectives of this study have been: to design of primers and probes sets, for detection of White spot syndrome virus (WSSV) and Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV); to verify the compatibility of both probes under the same reaction; to optimize the annealing temperature for all primers and probes sets; to measure the sensibility of the technique for theses ones, and to develop a standardized protocol in the detection of both pathogens simultaneously. The WSSV DNA samples came from the reference centre CENIAQUA (Colombia), and the IHHNV DNA samples cames from a commercial company, BIOGEMAR S.A. (Ecuador). As shrimp DNA free of pathogens were samples from commercial market, coming from Ecuador, where they are previously analysed in the Fishery National Institute (INP) before exportation. These last samples were used for checking unspecific hybridization. The designed primers and probes, considered their compatibility, not only between WSSV and IHHNV, but also with other pathogens of interest in the sector such as NHP and MBV, in order to be incorporated into the diagnostic reaction in the future. With all the obtained results, a final protocol has been elaborated that meets the conditions of temperature and time necessary in each cycle, the number of cycles, the amount of genetic material to be analyzed and the design of primers and probe required for the correct operation of the test.